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基于需要遞轉(zhuǎn)不同種類核酸/蛋白類型研究,在細(xì)胞轉(zhuǎn)染環(huán)節(jié),研究者們常碰到如下三類問題:
- 細(xì)胞對(duì)化學(xué)試劑較為敏感,轉(zhuǎn)染后,細(xì)胞活率下降或死亡;
- 研究常用細(xì)胞類型較多,不同類型細(xì)胞,轉(zhuǎn)染效率差異較大,導(dǎo)致單個(gè)轉(zhuǎn)染試劑或者實(shí)驗(yàn)流程,無(wú)法滿足實(shí)驗(yàn)需求;
- 遞轉(zhuǎn)多種類型核酸或蛋白,需要挑選對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)染試劑,并且需要大量實(shí)驗(yàn)優(yōu)化,才可以得到較高的轉(zhuǎn)染效率。
有沒有一款化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑,可以同時(shí)應(yīng)對(duì)常規(guī)到難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型,有著較低的細(xì)胞毒性,并且適用于多種核酸/蛋白類型遞轉(zhuǎn)呢?兼具多重功能、高性能的TransIT-X2®轉(zhuǎn)染試劑,可同時(shí)應(yīng)對(duì)常見細(xì)胞及難轉(zhuǎn)染細(xì)胞類型,避免條件摸索和大量的重復(fù)性實(shí)驗(yàn),輕松得到您理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
- 已驗(yàn)證在大多數(shù)細(xì)胞類型中(如貼壁/懸浮細(xì)胞、原代細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等),都有著優(yōu)異的轉(zhuǎn)染效率、低毒性(特別相對(duì)于形成脂質(zhì)體復(fù)合物的Lipofectamine®系列試劑)、高性能的表現(xiàn);
- 適用于多種研究領(lǐng)域,包括但不限于干細(xì)胞研究、基因編輯CRISPR研究、RNAi基因干擾/沉默、穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建、低毒性的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)、共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)等;
- 允許高效且穩(wěn)定的同時(shí)遞轉(zhuǎn)多種核酸/蛋白類型,包括但不限于質(zhì)粒 DNA、siRNA/miRNA 和 CRISPR/Cas9 組分。
為什么Mirus TransIT-X2® Dynamic Delivery System有著如此高性能及廣泛適應(yīng)性呢?這歸因于Mirus強(qiáng)大且高效的專利遞轉(zhuǎn)平臺(tái)設(shè)計(jì),可進(jìn)行多重、多功能組合的轉(zhuǎn)染試劑組分篩選并優(yōu)化。成立于1995年的Mirus,專注及深耕核酸遞轉(zhuǎn)領(lǐng)域多年(圖1),從最早具有低毒性的TransIT ® -LT1到GMP級(jí)別、可用于AAV和LV生產(chǎn)的TransIT-VirusGEN®,都是基于該遞轉(zhuǎn)平臺(tái)進(jìn)行設(shè)計(jì)及開發(fā)的。截至目前,使用Mirus產(chǎn)品發(fā)表文章已超過(guò)1萬(wàn)篇,并且發(fā)表文章及Mirus數(shù)據(jù)庫(kù)涵蓋了超過(guò)1200種細(xì)胞類型,更多文章及數(shù)據(jù)查詢,請(qǐng)點(diǎn)擊這里。
圖1 Mirus產(chǎn)品年鑒
不同于傳統(tǒng)基于單組分的轉(zhuǎn)染試劑(如陽(yáng)離子聚合物或陽(yáng)離子脂質(zhì)體),為了進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)染效率,以應(yīng)對(duì)不同細(xì)胞類型或特定的應(yīng)用。Mirus將專利的多聚物(Polymer)及脂質(zhì)(Lipids)技術(shù)進(jìn)行多重組合,在不形成脂質(zhì)體復(fù)合物(即liposome,通常具有細(xì)胞毒性)前提條件下,得到多種類、高性能的轉(zhuǎn)染方案,克服細(xì)胞遞轉(zhuǎn)過(guò)程中的多重阻礙,以實(shí)現(xiàn)更高效轉(zhuǎn)染和更低的細(xì)胞毒性(圖2)。
圖2 Mirus轉(zhuǎn)染試劑原理示意圖
基于上述Mirus強(qiáng)大、高效的專利遞轉(zhuǎn)平臺(tái)設(shè)計(jì),在進(jìn)行多重、多組合篩選、優(yōu)化及后續(xù)驗(yàn)證,獨(dú)有的智能迭代設(shè)計(jì)流程,優(yōu)化轉(zhuǎn)染技術(shù)中的每個(gè)組分(圖3)。Mirus推出一系列經(jīng)典轉(zhuǎn)染試劑,以應(yīng)對(duì)多種需求:
- 廣譜、高性能、低毒性的轉(zhuǎn)染試劑家族: TransIT-X2®、TransIT®-LT1、TransIT®-2020
- 針對(duì)特定細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)染試劑家族:TransIT®-293、TransIT®-BrCa、TransIT®-CHO、TransIT-HeLaMONSTER®、TransIT®-Insect、TransIT®-Jurkat、TransIT®-Keratinocyte
- 針對(duì)特定應(yīng)用的轉(zhuǎn)染試劑家族:
- 病毒生產(chǎn):VirusGEN® 轉(zhuǎn)染試劑及配套試劑盒、TransIT®-Lenti
- 蛋白/抗體生產(chǎn):TransIT-PRO®、CHOgro® Expression System、CHOgro® High Yield Expression System
- 寡核苷酸遞轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)染家族:TransIT®-Oligo、TransIT-siQUEST®、TransIT-TKO®
- mRNA及長(zhǎng)鏈RNA遞轉(zhuǎn):TransIT®-mRNA
圖3 Mirus獨(dú)有智能迭代設(shè)計(jì),轉(zhuǎn)染試劑優(yōu)化流程示意圖
Mirus TransIT-X2®轉(zhuǎn)染試劑性能數(shù)據(jù)展示
Mirus TransIT-X2®Dynamic Delivery System遞轉(zhuǎn)表達(dá)EGFP質(zhì)粒DNA分別至A549、CHO-K1、Hep G2、MDCK、LNCaP、PC-12、原代人乳腺上皮細(xì)胞(HMEC)和正常人真皮成纖維細(xì)胞(NHDF)細(xì)胞中。實(shí)驗(yàn)使用96孔板, TransIT-X2®試劑加入量為0.2-0.4μl,DNA加入量為0.1μg(使用試劑:DNA=2:1、3:1或4:1)。轉(zhuǎn)染后48小時(shí),使用Guava® easyCyte? 5HT流式細(xì)胞儀重復(fù)檢測(cè)三次,評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。
圖4 TransIT-X2®在包括原代細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞類型中都具有較高轉(zhuǎn)染效率
使用TransIT-X2®(Mirus Bio)、Lipofectamine®2000 (Thermo Fisher Scientific)或Lipofectamine®3000 (Thermo Fisher Scientific)轉(zhuǎn)染熒光素酶編碼質(zhì)粒DNA至A549 (A)或MDCK (B)細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染24小時(shí),通過(guò)熒光素酶活性評(píng)估轉(zhuǎn)染效率,定量受損細(xì)胞中釋放的LDH評(píng)估細(xì)胞毒性。與Lipofectamine®2000或Lipofectamine®3000的細(xì)胞相比,在最佳試劑:DNA比例下,Trans - x2®有著更高的熒光強(qiáng)度及更低的細(xì)胞毒性。
圖5 相較于使用單一組分且形成陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物(liposome)的Lipofectamine®系列轉(zhuǎn)染試劑,TransIT-X2®有著更高的轉(zhuǎn)染效率及更低細(xì)胞毒性
實(shí)驗(yàn)Tips: 針對(duì)更多特定細(xì)胞類型,試劑使用建議,詳細(xì)請(qǐng)見:Cell-type specific transfection protocol recommendations (PDF).
Mirus TransIT-X2®在RNAi干擾實(shí)驗(yàn)中性能數(shù)據(jù)展示
基因沉默相關(guān)功能研究在分子和細(xì)胞生物學(xué)中發(fā)揮著重要作用,化學(xué)轉(zhuǎn)染也在該研究領(lǐng)域扮演者重要角色。常見參與RNAi干擾途徑的天然RNA分子包括:
- 小干擾 RNA (Small interfering RNAs, siRNA) :由雙鏈 RNA(dsRNA)斷裂所產(chǎn)生的短雙鏈 RNA(20-25bp);
- 微小 RNA(MicroRNAs, miRNAs) :非編碼 RNA 處理后所產(chǎn)生的一類短的、單鏈 RNA(20-22nt)。
利用 RNAi 抑制基因表達(dá)的另一種方法為短發(fā)夾 RNA(short hairpin RNA , shRNA),這些短 RNA 序列可通過(guò)病毒或非病毒載體方式進(jìn)行表達(dá),更多詳細(xì)信息可查閱Mirus Applications | RNAi Gene Silencing。
圖6 不同RNAi干擾途徑示意圖
TransIT-X2®Dynamic Delivery System和Lipofectamine®2000轉(zhuǎn)染試劑用于轉(zhuǎn)染siRNA(靶點(diǎn)為內(nèi)源性蛋白質(zhì)- GAPDH和AHA1),對(duì)照使用正常人類真皮成纖維細(xì)胞(NHDF)遞轉(zhuǎn)非靶向siRNA。Trans IT-X2®加入量為4μl, Lipofectamine®2000加入量為6μl,siRNA加入量都為25 nM。使用qRT-PCR相對(duì)于18s rRNA水平測(cè)量GAPDH或AHA1 mRNA進(jìn)行檢測(cè),轉(zhuǎn)染后48小時(shí)均一化至非靶向?qū)φ战M的mRNA水平,誤差則為三次復(fù)孔實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)差。
圖7 基于siRNA核酸遞轉(zhuǎn)類型的基因沉默研究,相比Lipofectamine® 2000,TransIT-X2®有著更高的基因沉默效率
TransIT-X2®Dynamic Delivery System和Lipofectamine®2000轉(zhuǎn)染試劑用于轉(zhuǎn)染Pre-miR? hsa-miR-1 miRNA Precursor 或者mirVana? miRNA mimic, miR-1 (兩者都已驗(yàn)證,可降低PTK9 mRNA表達(dá)水平)。Pre-miR?陰性質(zhì)控用于評(píng)估mRNA表達(dá)水平基線值。Trans IT-X2®及Lipofectamine®2000試劑加入量都為3μl, 加入50 nM miRNA。使用qRT-PCR相對(duì)于18s rRNA水平,經(jīng)過(guò)陰性質(zhì)控的均一化,得到PTK9 mRNA表達(dá)水平值。
圖8 基于miRNA (miRNA Precursor及miRNA mimic)基因沉默研究,相比Lipofectamine® 2000,TransIT-X2®有著更高的基因沉默效率
Mirus TransIT-X2®在CRISPR基因編輯實(shí)驗(yàn)中性能數(shù)據(jù)展示
經(jīng)過(guò)改造及優(yōu)化的細(xì)菌 CRISPR/Cas9 系統(tǒng),已被廣泛應(yīng)用到哺乳細(xì)胞的基因編輯中?;?/span>CRISPR基因編輯實(shí)驗(yàn)常見兩組分:Cas9蛋白及引導(dǎo)RNA(gRNA)。當(dāng)Cas9蛋白切割了靶向基因組DNA,會(huì)觸發(fā)兩種內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制,即非同源末端連接(NHEJ)和同源定向修復(fù)(HDR),以應(yīng)對(duì)細(xì)胞中產(chǎn)生的DNA斷裂。基于NHEJ細(xì)胞修復(fù)通路,為非精準(zhǔn)、且容易出錯(cuò)細(xì)胞修復(fù)通路,可引入導(dǎo)致基因功能缺失的Indel。基于HDR的細(xì)胞修復(fù)通路,則需要額外的同源 DNA 作為修復(fù)模板,從而實(shí)現(xiàn)“精準(zhǔn)”修復(fù),在目的基因插入特定的基因或長(zhǎng)片段序列。
根據(jù)研究者們不同的實(shí)驗(yàn)需求,CRISPR基因編輯可以有多種類型實(shí)驗(yàn)設(shè)置,這意味需要面對(duì)不同核酸類型的轉(zhuǎn)染甚至共轉(zhuǎn)染,舉例如下:
1. 質(zhì)粒pDNA轉(zhuǎn)染
作為CRIPSR實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵兩組分:Cas9蛋白及gRNA,可以設(shè)計(jì)單個(gè)質(zhì)粒DNA,共同表達(dá)兩組分(A);或者使用兩質(zhì)粒系統(tǒng),其中一個(gè)質(zhì)粒表達(dá)Cas9蛋白,另外一個(gè)質(zhì)粒表達(dá)gRNA(B);當(dāng)使用Cas9切口酶(Nickase),則需要兩條gRNA,這時(shí)可能需要三質(zhì)粒系統(tǒng)的遞轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)。
2. 質(zhì)粒DNA及RNA寡核苷酸共轉(zhuǎn)染
此時(shí),與上述實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不同的是,gRNA以寡核苷酸形式進(jìn)行遞轉(zhuǎn),這就意味著遞轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)需要同時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA以及RNA寡核苷酸(A和B)。
3. mRNA及RNA寡核苷酸共轉(zhuǎn)染
為了避免由于質(zhì)粒DNA基因組整合而導(dǎo)致的脫靶效應(yīng),可以共轉(zhuǎn)染編碼Cas9蛋白的mRNA及gRNA (RNA寡核苷酸)。
4. Cas9/gRNA RNP復(fù)合物遞轉(zhuǎn)
隨著Cas9蛋白及gRNA商品化趨于成熟,越來(lái)越多的研究者們選擇直接從第三方購(gòu)買高保真Cas9蛋白,以及有著額外化學(xué)修飾且在細(xì)胞內(nèi)更穩(wěn)定的gRNA寡核苷酸。除了極大的縮短和簡(jiǎn)化CRISPR實(shí)驗(yàn)流程外,相對(duì)于質(zhì)?;蛘?/span>mRNA方式合成,直接遞轉(zhuǎn)RNP復(fù)合物的方式有著更高的特異性及編輯效率。
實(shí)驗(yàn)Tips: 針對(duì)上述不同CRISPR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及遞轉(zhuǎn)情形,TransIT-X2® Dynamic Delivery System經(jīng)優(yōu)化的具體實(shí)驗(yàn)說(shuō)明, 下載鏈接如下:
TransIT-X2® for CRISPR Plasmid + gRNA Delivery (PDF)
TransIT-X2® for CRISPR Plasmid Delivery (PDF)
TransIT-X2® for CRISPR RNP + ssODN Delivery (PDF)
TransIT-X2® for CRISPR RNP Delivery (PDF)
使用TransIT-X2® Dynamic Delivery System (2 μl/孔,24孔板, Mirus Bio)共轉(zhuǎn)染0.5 μg質(zhì)粒DNA(表達(dá)Cas9蛋白)及50nM 2-part gRNA (PPIB基因)至HEK293T/17, U2OS 及NHDF細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染后48小時(shí),T7E1驗(yàn)證切割效率。
圖9 質(zhì)粒DNA和gRNA寡核苷酸共轉(zhuǎn)染:TransIT-X2®分別在293T/17、U2OS和NHDF細(xì)胞中共轉(zhuǎn)Cas9質(zhì)粒DNA與gRNA(RNA寡核苷酸),都有著較高的基因編輯效率(18-48%)
2-part gRNA (PPIB基因,IDT) 及Cas9 蛋白(PNA Bio)形成RNP復(fù)合體,分別使用TransIT-X2® Dynamic Delivery System(1 μl/孔, Mirus Bio)、Lipofectamine® CRISPRMAX? (1.5 μl/孔, ThermoFisher) 、Lipofectamine® RNAiMAX (1.5 μl/孔, ThermoFisher) 、Lipofectamine® 3000 (1.5 μl/孔ThermoFisher) 遞轉(zhuǎn)至293T/17及U2OS細(xì)胞中。測(cè)試gRNA兩種使用量(6 nM或12 nM),相同Cas9 蛋白加入量(6 nM),轉(zhuǎn)染后48小時(shí),T7E1驗(yàn)證切割效率。
圖10 Cas9/gRNA RNP復(fù)合體遞轉(zhuǎn):相較于Lipofectamine®系列轉(zhuǎn)染試劑,TransIT-X2®有著更高的切割效率
Mirus TransIT-X2®產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)
?新型基于多組分開發(fā)的廣譜型轉(zhuǎn)染試劑(適用于多種細(xì)胞,包括難轉(zhuǎn)細(xì)胞);
? 可同時(shí)轉(zhuǎn)染核酸及蛋白,包括不限于DNA,siRNA/miRNA和CRISPR/Cas9復(fù)合物;
?不形成脂質(zhì)體復(fù)合物,降低細(xì)胞毒性;
? 滿足多種應(yīng)用:基因過(guò)表達(dá)、基因沉默、基因編輯、干細(xì)胞研究、穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建等。
相關(guān)產(chǎn)品信息
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
貨號(hào) |
TransIT-X2® Dynamic Delivery System |
1 × 0.3 ml |
MIR 6003 |
1 × 0.75 ml |
MIR 6004 |
|
1 × 1.5 ml |
MIR 6000 |
|
5 × 1.5 ml |
MIR 6005 |
|
10 × 1.5 ml |
MIR 6006 |
文末福利:
關(guān)注西美杰微信公眾號(hào)“xmjsci”,回復(fù)關(guān)鍵詞“X2試用”,填寫信息即有機(jī)會(huì)免費(fèi)獲取100μl TransIT-X2®轉(zhuǎn)染試劑試用裝。試用成功后還可享優(yōu)惠折扣購(gòu)買TransIT-X2®正裝哦,快來(lái)試用搶購(gòu)吧!
美國(guó)Mirus公司成立于1995年,是世界上很早開發(fā)高效、低毒轉(zhuǎn)染試劑的公司,同時(shí)也是目前該類試劑主要的供應(yīng)商之一。Mirus被公認(rèn)為轉(zhuǎn)染試劑開發(fā)的領(lǐng)跑者,其許多杰出成果獲得世界公認(rèn)與廣大用戶的好評(píng)。
北京西美杰科技有限公司是Mirus中國(guó)區(qū)代理,始終秉承著專業(yè)、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽B(tài)度為客戶提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品與服務(wù)。如果您對(duì)上述產(chǎn)品感興趣,歡迎致電北京西美杰客服熱線400-050-4006或登錄網(wǎng)站www.laojubing.cn了解更多產(chǎn)品信息。